СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: Фундаментальная биология и медицина - Начало ...  

ПРОДОЛЖЕНИЕ

В геноме соматических клеток отсутствуют «программы» лечения. Геномика  аномальных клеток использует  несколько вариантов  апоптоза для аутоэлиминации ненормальных клеток. С  другой стороны  пересадки стволовые клетки ускоряют самообновление клеток в органах, в том числе элиминацию  патологически измененных клеток.

Для исследователей Эск- это  «шпаргалка» для расшифровки работы генома (особенно в период раннего эмбриогенеза и органогенеза). Необходимо напомнить, что  изучение эмбриогенеза человека ограничено по биоэтическим соображениям. Постимплантационный эмбриогенез млекопитающих мышей, крыс, других лабораторных млекопитающих имеет существенные отличия. Во многих ситуациях Эск остаются единственной экспериментальной возможностью для моделирования событий, происходящих в зародыше человека после имплантации. Таким образом, Эск человека и млекопитающих – незаменимый путь для изучения  аномалий постимплантационного развития зародышей. Самые ранние события кардиогенеза, миогенеза, нейрогенеза с дешифровкой soft-программ  самосборки клеток в органы доступны пока лишь в культуре Эск (Kehat I., Kenyagin-Karsenti D., Snir M. Et al.,2001).

 Для Эск характерно два варианта запрограммированного поведения в культуре. 1) незрелые Эск длительно размножаются  в присутствии фидерного слоя клеток и ростовых факторов. 2) после наработки  массы недифференцированных клеток, рамножение клеток останавливают, изменяя условия культивирования. Начинается дифференцировка клеток  (желательно в один тип специализированных клеток) .  (Рис 1-1)

Эск  назвали "лабораторными лошадками" регенерации (Petit-Zeman, 2001), потому что  регенерация органов практически невозможна за счет резерва собственных дифференцированных клеток. Эск  «банкируются» in situ и повторяют фрагменты эмбриогенеза в тканях взрослого организма. Некоторые линии Эск человека  удавалось пассировать без изменения фенотипа более 2 лет. Такие культуры прошли 300-450 циклов удвоения клеток без возникновения анеуплоидии или опухолей. При устранении фидера, ростовых факторов, а также после добавления сигналов начиналась медленная многоэтапная дифференцировка Эск в популяции дефинитивных, необратимо специализированных клеток. Интересно, что дифференцировка Эск в нейроны, кардиомиоциты идет за 10-15 дней, тогда как аналогичные процессы линейного созревания клеток в эмбрионе идут 5-7 нед (Kawasaki H., Suemori H., Mizuseki K. et al.,2002). В последнее время стали использовать сигналы фидерного слоя клеток для ускоренной дифференцировки клеток в культуре.

В зародыше и взрослом организме потенции генома стволовых клеток  существенно варьируют по  "ассортименту" фенотипа специализированных клеток. Более ранние, тотипотентные Эск дифференцируются в любую из 250 линий специализированных клеток органов. Необходимо подчеркнуть, что Эск in vitro не продуцируют клеток трофобласта, плаценты, т.е.  потенции генома Эск меньше зиготы.. Соответственно биологический статус Эск меньше статуса раннего зародыша.  Плюрипотентные Эск дают более ограниченный спектр фенотипов. Например, мезенхимальные стволовые клетки (Мск), локализованные в опорно-сосудистом каркасе  органов, дифференцируются в культуре только в клетки хряща, кости, кардиомиоциты и миоциты. Монопотентные стволовые клетки (мышц, жировой ткани, периферических нервов) созревают до одного преобладающего фенотипа клеток. Стволовые региональные клетки взрослого организма наделены мультипотентностью-  пластичной плюрипотентностью, которая сильно варьирует в контексте органа-реципиента. Так, пересадки гематогенных стволовых клеток в мозг, сердечную или стволовые клеткиелетную мышцу приводили к образованию ткане-специфичных ростков донорской ткани в органах реципиента. Однократное переливание 0,5 л донорской женской крови  мужчине-реципиенту химеризует женскими клетками все паренхиматозные органы (Korbling M., Katz R.L., Khanna A. et al., 2002). Большое внимание уделяется сейчас мультипотентным Мск взрослых органов, поскольку эти клетки хорошо мигрируют и  многократно химеризуют ткани. В свою очередь, пересадки нейрональных стволовых клеток в печень, мышцу или иммунную систему сопровождались тканеспецифичной перестройкой фенотипа донорских клеток. Хорошо доказано,  что сигналы микроокружения играют решающую роль в судьбе трансплантированных Эск/Мск in situ. Существенно, что Эск/Мск при дифференцировке в культуре давали лишь "природные" линии дифференцированных клеток, которые встречались в организме взрослого животного и человека. Никаких новых типов клеток или неизвестных линий дифференцированных клеток из Эск не возникало  in vitro (O'Shea, 1999). Наблюдения подтверждены  другими многочисленными работами, что снижает риск осложнений и повышает безопасность клеточной терапии дериватами стволовых клеток.

Тотипотентность Эск in situ проверяется несколькими способами. При трансплантации в морулу или бластоцисту донорские Эск встраиваются сначала в эпибласт и провизорные органы. Далее они мигрируют практически во все органы плода. После рождения ростки донорской ткани, дериватов Эстволовые клетки, выявляются и прогрессируют в костном мозге, кишечнике, коже, костях, печени, головном мозге,  иммунной системе. Показано, что миграция Эск в ранних зародышах велика и практически не лимитирована до стадии сегментации. Пересадки Эск использовали для подсчета числа founder newmed в закладках органов мыши, крысы, приматов. Усредненная эффективность химеризации линейно зависела от числа донорских клеток, заселивших эпибласт – главный орган образования founder newmed. Идентичные пересадки Мск в морулу/бластоцисту овец и мышей приводили к накоплению и размножению донорских клеток только в костной, жировой, гематогенной, иммунной системе. Мск  лишь ограничено накапливались в строме печени, легких, почек и мозга (Liechy KW, MacKenzie TC, Shaaban Af, 2000). Несовпадающее распределение Мск и Эск по тканям развивающихся эмбрионов является их важным отличительным маркером. Имплантация Эск и Мск в ранние зародыши никогда не заканчивалась малигнизацией. Показано, что Эск мыши (приматов) встраиваются в морулу, бластоцисту, эпибласт зародыша крысы. Закономерности встраивания Мск в эпибласт не изучены. Только часть территории эпибласта  доступна для встраивания Мск. Поразительно, как клетки разных видов без помех взаимодействуют на уровне рецепторов, сигналов, программ,  темпов развития химер. Химеры реализуют один трехмерный план строения без морфоаномалий (тератогенеза). У  клеточных химер всегда доминирует  морфотип беременной самки (O'Shea, 1999). Для стволовые клеткирининга тотипотентности in situ Эск пересаживали в разные органы иммунодефицитных мышей, либо изогенных животных (для исключения иммунного отторжения). Если пересадки предимплантационных зародышей в мозг всегда заканчивались резорбцией, то пересадки Эск в виде агрегатов (эмбриональных телец) давали стабильные ростки дифференцированной нервной ткани. На стадии эмбриоидных телец постмитотические клетки  начинали дифференцироваться in vitro, необратимо теряя способность генерировать опухоли. Пролиферирующие незрелые Эск при пересадке в брюшную полость, под кожу или под капсулу почки давали опухоли (эмбриотератомы) у взрослых особей. Чем медленнее росла опухоль, тем больше была доля спонтанно дифференцированных клеток (Robertson, 1987; Watt, 2000). Эмбриотератомы содержали эпителий тонкого кишечника, миоциты, нейроны, кардиомиоциты, гладкомышечные клетки, фрагменты волос, кожи, хряща и кости. .

Поэтому линии Эск тщательно проверяются на канцерогенность в случае пересадок животным. Пересадки Эск в мозг никогда не сопровождались возникновением кардиомиоцитов, миоцитов или кожи. В свою очередь трансплантаты Эск в сердце не давали нейронов или секреторных клеток кишечника. Локальная дифференцировка Эск in situ, как правило, контролировалась "сигналами" микроокружения.  Тотипотентность Эск человека проверяли по понятным причинам лишь на животных. Ограниченные клинические наблюдения также подтвердили отсутствие аномалий дифференцировки стволовых клеток в трансплантате.

Рост Эск в культуре идет клонами. В отличие от обычного экспоненциального размножения клеток в культуре, клон не растет, а самообновляется. Только в клоне сохраняется микроокружение, позволяющее стволовым клеткам удерживать  необычно высокую  генетическую потенцию. Эта особая геномика клеток сохраняется и воспроизводится только в плотной сфере. Каждая культура Эск имеет варьирующую долю клеток  в суспензионных агрегатах (сферах). Одиночные клетки, покидая клон, неизбежно дифференцируются. Лишь агрегаты составляют суммарное пространство плюрипотентных клеток, остальные клетки специализируются под влиянием  микроокружения.  Большинство новых фенотипов возникает по периферии клонов. В каждом клоне клетки одновременно  дифференцируются в разные фенотипы, подтверждая важность микроокружения (мозаика инструкций-сигналов может быть весьма разнообразной даже внутри одного клона).

Известно, что в первичной культуре эмбриобласта (эпибласта) обязательно  сохраняют первичные агрегаты клеток при получении линий Эск  (Talbot N.C., Carrett W.M., 2001) Одноклеточные суспензии эпибласта/эмбриобласта зародышей человека и обезьяны практически не выживали в первичной культуре. Внешние слои клона более активно пролиферировали в среде с ростовыми факторами (LIF, SCF, IL-6, bFGF, EGF,TGF-alpha). Состав и оптимальные концентрации факторов пролиферации подбираются эмпирически в каждой культуре. Более продвинутые клетки по периферии сфер гибли в селективной среде, предназначенной для выживания наименее зрелых популяций. Когда клеточные агрегаты достигали размера 30-50 клеток, наступало равновесие между пролиферацией и апоптозом. Каждый клон – это микромодуль самообновления клеток в постоянном миниобъеме. Репертуар прогениторных клеток постоянно меняется без изменения самого стволового пространства. Провизорные клоны сменяются дефинитивными клетками за счет множественных циклов самообновления клеток. Спонтанную дифференцировку и гибель клеток предотвращали повторным диспергированием агрегатов. Клоногенность – это способность культуры генерировать разную численность клон-инициирующих клеток на мл. Пока клоногенность существующих линий находилась на  уровне  1-2 % (Pera M.F., 2001). Сигналы, запускающие инициацию клонов, практически не изучены.  Выявлены варианты Эстволовые клетки, в которых исходно экспрессированы разные наборы генов, отвечающих за два главных качества клона: 1) плюрипотентность генома 2) самообновление прогениторных клеток (Morrison S.J., Shah N.M., Anderson D.J.,1997).

  Даже малые концентрации сыворотки  полностью блокировали клон-инициирующие клетки. В бессывороточной среде с помощью комбинации митогенов (bFGF, LIF) в лучшем случае удавалось поднять инициацию клонов в 3,5 раза. В каждом клоне присутствовали две популяции незрелых клеток с разным механизмом пролиферации. В ядре клона пролиферировали самообновляющиеся клетки с минимальным фенотипом и максимальной плюрипотентностью. На периферии клона некоммитированные прогениторные слои вступали в цикл созревания, который сопровождался усложнением белкового фенотипа и уменьшением генетической потентности клеток. Если в зародыше млекопитающих на стадии органогенеза половина клеток приходилась на провизорные некоммитированные клоны стволовых клеток, то в фетальной печени одна стволовая гематогенная клетка уже приходилась на 100000 гематогенных клеток. В кроветворной ткани взрослого человека насчитывается одна гематогенная стволовая клетка на 2-10 миллионов коммитированных клеток.  Даже в короткоживущих организмах как дрозофила, многие клоны стволовых клеток в яичнике имеют среднюю продолжительность жизни около 20-25 дней (Morrison S., Shah N.M., Anderson D.,1997). Пока точно количественно не подсчитано, какое количество Эск выживает в разных органах человека и мыши после рождения.

Недавно получены линии мышиных Эск с эффективностью образования клонов порядка 20%. Их источником стали культуры Эстволовые клетки, меченые цветными белками, поставленными под промотор ранних генов (Rex-1), экспрессированных в Эск. Все светящиеся клетки отбирали на сортере, а  линии получали из высокоочищенного сырья, поскольку продвинутые клетки всегда блокировали выживаемость и пролиферацию клон-инициирующих клеток. Эмпирически из очищенной популяции клеток удавалось получить культуры с 10-20%  клоногенностью (Pera M.F., 2001). Существенно, что часть таких клонов стабильно сохраняла высокий индекс клеточной пролиферации.

Более продвинутые клетки не только конкурировали со стволовыми незрелыми клетками за лимитирующие факторы питания, но и секретировали в среду факторы, блокирующие плюрипотентность генома незрелых клеток. Культивирование стволовых клеток всегда начиналось с  селективной среды, где 99% продвинутых клеток погибали, а малая часть выживших стволовых клеток начинала пролиферировать.

Рис 1-2. Основные характеристики Эск 

·         происхождение:  клетки эпибласта, половые прогениторные клетки, перенос ядра донорской клетки в цитоплазму ооцита

·         стабильная пролиферация без генетической модификации и онко-иммортализации

·         клоногенный рост с самообновлением клеток

·         плюрипотентность генома: источник всех фетальных и взрослых клеток кроме трофобласта и  провизорных транзиторных клеток (нервный гребень и т.п.)

·         рецептор – и GP-130- опосредованная супрессия дифференцировки плюрипотентных клеток

·         Oct4 –опосредованное ингибирование транскрипции генома

·         Отсутствие G1 –фазы митоза 

·          Отсутствие Х - инактивации  в ХХ - клетках

·         Колонизация всего зародыша, включая половой зачаток

·         Видовые и тканевые  различия  в чувствительности Эск к митогенам и индукторам клеточной дифференцировки

Периферия клона  использует "навигационную" информацию для направленного перемещения клеток. Пролиферация и миграция клеток отвечают за экспансию клонов и рост зародыша. Клон - эта повторяющийся модуль переноса и реализации software онтогенеза, в котором тотипотентность генома кодируется сначала наборами мРНК, а позднее - новым репертуаром белков.