СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

Клеточные технологии и современная медицина.

(Клеточные технологии и современная медицина: стволовые клетки)

Н.А. Онищенко.

НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. г. Москва.

(Директор академик  В.И. Шумаков).

XX век можно по праву назвать столетием триумфального развития методов восстановительного лечения необратимо поврежденных органов путем трансплантации донорских органов и клеток.

Признанием огромной значимости для человечества развития трансплантационного направления медицины явилось присуждение в 1990 г. единой Нобелевской премии в области медицины двум выдающимся исследователям-врачам: E.D. Thomas за разработку и внедрение трансплантации клеток костного мозга и G. Murray за разработку и внедрение пересадок почек в клиническую практику.

Благодаря клинической эффективности трансплантационные методы восстановительного лечения получили всеобщее признание, однако, в последние три-четыре десятилетия продолжали изучаться и совершенствоваться преимущественно методы клеточной трансплантации.

Разработке методов клеточной терапии способствовали: повсеместно усиливающийся дефицит донорских органов и высокая себестоимость трансплантации, опасность развития осложнений, сопутствующих большой хирургии, а также чрезвычайно высокий процент инвалидизации и гибели больных от хронических заболеваний жизненно важных органов.

Выяснилось также, что клеточная трансплантация имеет даже ряд преимуществ по сравнению с органными трансплантациями: метод имеет более низкую себестоимость, безопасен, позволяет обеспечить медицинской помощью большее число больных, а также отказаться полностью или использовать слабые иммуносупрессивные препараты.

Стало очевидным, что с помощью метода клеточной трансплантации появляется возможность возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток в поврежденных органах, возможность увеличения пула функционирующих клеток, а также активизации в сохранившихся клетках поврежденного органа собственного резерва регенерации и пролиферации.

Первоначально возможности клеточной трансплантации стали изучаться при разработке нетрадиционных методов лечения инсулинзависимого сахарного диабета и ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы, прежде всего болезни Паркинсона [8,16,17,55].

В дальнейшем клеточные биотехнологии стали использоваться для лечения ишемических и травматических поражений разных органов, для лечения хронических воспалительных и некоторых системных заболеваний, таких как атеросклероз, онкологические заболевания, мышечная дистрофия Дюшенна, болезнь Вильсона и др. Аналитический обзор этих данных содержится в работах ряда отечественных авторов [2,3,10,14,20].

В практике применения клеточных технологий можно четко выделить 2 подхода, которые различаются научно-методологическими принципами, положенными в их основу. Первый подход – более ранний – связан с применением специализированных (дифференцированных) клеток растущих организмов (человека и животных). Второй подход начал развиваться последние 3 -5 лет и связан с разработкой технологий применения недифференцированных (стволовых) клеток человека.

1. Применение специализированных (дифференцированных) клеток из растущих организмов для восстановительного лечения поврежденных органов.

Терапия специализированными донорскими клетками, выделенными из растущих организмов, по сути представляет собой дальнейший этап развития метода тканевой терапии, учитывающий достижения современной клеточной биологии и трансплантационной иммунологии.

Метод провозглашает отказ от медикаментозной коррекции биохимического беспорядка в пораженных клетках и нацелен на возмещение в органах отсутствующих клонов специализированных клеток, а также участие трансплантированных клеток в восстановлении гомеостатических функций сохранившихся клеток пораженного органа.

Технически этот метод клеточной терапии в клинике стали выполнять двумя способами: путем непосредственной трансплантации донорских клеток в строго заданные участки тканей поврежденных органов (например, доставка нейрональных клеток с помощью стереотаксической техники) или доставки клеток в соответствующие органы током крови (например, при интрапортальном введении клеток островковой ткани поджелудочной железы), а также путем дистанционного управления процессами регенерации и пролиферации в поврежденных органах за счет временного размещения донорских клеток в экстракорпоральном контуре перфузионных систем, осуществляющих инкубацию донорских клеток в потоке крови или плазмы больного (например, клеток печени, селезенки) [7,20,35].

Изучение корригирующих возможностей этих двух технически различающихся методов клеточной терапии позволило установить ряд общих закономерностей реализации их воздействия на организм. Было констатировано, что стабильность, выраженность и длительность лечебного эффекта при использовании клеточных технологий находится в прямой зависимости от количества паренхимы, сохранившейся в пораженном органе и способной отвечать на регуляторные сигналы, а также от суммарной массы биологической активности используемого материала. Кроме того, определяющее значение для выраженности и длительности функционирования пересаженных клеток имеет степень биологической (биохимической) адекватности микроокружения, так как именно физиологически активные вещества микроокружения или, как их называют, сигнальные молекулы определяют реализацию генетической программы пересаженных клеток. Наиболее выраженный клинический эффект отмечался  при пересадках клеток в органы с аналогичным фенотипом клеток.

Между тем, оказалось, что даже при пересадке дофаминэргических нейронов от поздних эмбрионов (6-9 недель гестации) в ткань мозга, которая, как известно, окружена гемато-энцефалическим барьером, положительная динамика у больных с болезнью Паркинсона обычно нарастала только в течение первых 3-6 месяцев после операции (период развития пересаженных нейронов и установления их связей с мозгом больного) и затем шла на убыль за счет постепенной дегенерации и гибели трансплантированных нейронов.

Было высказано предположение, что гибель трансплантированных нейронов при этом может быть связана с отсутствием в мозге взрослого реципиента микросреды, обеспечивающей их выживание и развитие: отсутствует выработка определенного спектра ростовых нейротрофических факторов эмбрионального или плацентарного происхождения.

Не исключено также, что эмбриональные нейроны, будучи аллотрансплантатами, отторгаются реципиентом, поскольку нервные клетки поздних зародышей человека уже синтезируют антигены гистосовместимости, а стереотаксические манипуляции временно нарушают гематоэнцефалический барьер. В результате трансплантированные клетки становятся доступными не только для антител, но и для активированных лимфоцитов, ответственных за их отторжение и гибель.

Возможно также, что постепенная гибель трансплантированных клеток (даже аутотрансплантированных) и появление активных лимфоцитов могут быть обусловлены отсутствием полной интеграции этих клеток тканями реципиента из-за их предварительной изоляции, которая в последующем ослабляет чувствительность цитоплазматических мембран к сигналам межклеточных взаимодействий.

К тому же, не устраняется первопричина заболевания, и сохраняющиеся патологические воздействия могут способствовать гибели и трансплантированных донорских клеток.

Очевидно, действием всего спектра аналогичных факторов следует объяснять ограниченность сроков клинического эффекта клеточной терапии (не более 6-12 месяцев) и при лечении гипотиреоза, диабета, болезни Вильсона, а также других хронических заболеваний печени и других органов [7,20,21].

 В процессе изучения терапевтических возможностей метода клеточной трансплантации стало очевидным, что главным препятствием на пути внедрения клеточных технологий в широкую клиническую практику служат ограничения в получении достаточных количеств биоматериала – специализированных (дифференцированных) клеток с высокой биологической активностью, которой, как известно, обладают клетки из тканей молодых развивающихся организмов.

Для целей терапии использовались клетки из тканей поздних
эмбрионов человека со сроками развития 5-8 недель гестации, когда
заканчивается закладка эмбриональных зачатков тканей и органов; клетки
фетальных тканей человека со сроком развития плода свыше 8-12 недель
гестации, а также клетки из тканей органов новорожденных или
неполовозрелых животных (при необходимости получения больших объемов
клеточной массы). Клеткам из тканей развивающихся организмов отдается особое предпочтение, так как эти специализированные клетки имеют очевидное биологическое преимущество перед специализированными клетками взрослых доноров. Во-первых, большинство фетальных клеток имеют слабо экспресированные комплексы главных антигенов гистосовместимости (МНС-1 и МНС-2). Во-вторых, фетальные органы содержат наряду с уже дифференцированными клетками – бластные и региональные стволовые клетки, наделенные мощным потенциалом пролиферации; в-третьих, фетальные клетки за счет стволовых и бластных популяций, секретируют в организме реципиента уникальный комплекс цитокинов и ростовых тканеспецифических факторов, которые стимулируют регенерацию поврежденных тканей человека.

Чтобы уйти от проблем острого дефицита аллогенного донорского материала и от проблем биоэтики, возникающих при использовании человеческого абортивного материала, в 80-х годах прошлого столетия для клеточной терапии клиницисты стали широко использовать ксеногенный биоматериал.

Так, для лечения инсулинзависимого сахарного диабета была разработана технология получения островковых клеток из поджелудочной железы плодов свиней и коров, а затем из поджелудочной железы новорожденных кроликов.

Для лечения острой и хронической печеночной недостаточности различного генеза в экстракорпоральных контурах систем "Вспомогательной печени" стали использовать гепатоциты свиней препубертатного возраста (до 2 месяцев развития), так как эти клетки обладают не только высоким регенерационным потенциалом, но и способностью к выполнению органоспецифических детоксикационных функций.

Еще в начале 90-х годов прошлого столетия для усиления биорегуляторной активности гепатоцитов их инкубацию в экстракорпоральных контурах перфузионных систем стали проводить совместно с фрагментами селезенки тех же животных [7].

Использование селезенки в комплексном лечении заболеваний печени обосновывалось тем, что будучи важным органом иммуногенеза, селезенка подобно плодным тканям и клеткам костного мозга, даже во взрослом организме, содержит стволовые клетки и сохраняет достаточно высокий уровень обновления своего клеточного состава. Именно поэтому селезенка является мощным источником цитокинов и ростовых факторов – индукторов восстановительных процессов в клетках паренхиматозных органов. Кроме того, было показано, что Т-лимфоциты, которые служат в организме переносчиком регенерационной информации паренхиматозным клеткам нелимфоидных органов, завершают свое превращение в иммунокомпетентную клетку в селезенке, становясь способными к кооперативному взаимодействию с В-лимфоцитами при клеточно-опосредованном гуморальном иммунном ответе. Это обстоятельство и предопределило тот факт, что на протяжении последних 20 лет спленотерапия животными тканями стала интегральной частью комплексного лечения острой и хронической недостаточности функций жизненно важных органов, формирование которых всегда развивалось на фоне выраженного иммунодефицита.

Между тем, сохраняющийся дефицит донорского материала для лечения больных методами клеточных трансплантаций, призыв к ограничению использования ксеногенных источников из-за их более высокой антигенности, опасности заражения прионами и другими инфекциями, а также необходимость стандартизации используемых клеток и приготовления из них клеточных препаратов обусловили в последние 3-5 лет пробуждение необычайного интереса исследователей всего мира к проблеме стволовых клеток и к их так называемому «терапевтическому клонированию».

 

2. Биологические возможности применения стволовых клеток для восстановительного лечения поврежденных органов.

2.1. Общая характеристика и номенклатура стволовых клеток.

Стволовые клетки (СК) это клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в другие типы клеток.

СК характеризуются наличием трех главных свойств:

СК ассиметрично делятся, то есть при пролиферации СК ( стволовые клетки ) вместо образования 2-х одинаковых дочерних клеток одна- дочерняя клетка становится коммитированной (commit – поручать, вверять), способной стать более специализированной, а другая – остается неспециализированной СК ( стволовые клетки );

СК способны к самообновлению, т.е. репопулируют (пролиферируют без дифференцировки) на протяжении неопределенно длительного периода времени или даже в течение всей жизни организма (long-term subset);

СК могут дифференцироваться в специализированные типы клеток (по крайней мере в клетки 2-х различных фенотипов), проходя стадию прогениторных клеток (progenitor - предшественник) из так называемого краткосрочно существующего пула неспециализированных коммитированных СК ( стволовые клетки ) (short-term subset).

По происхождению различают 2 группы СК ( стволовые клетки ) – эмбриональные и региональные (взрослые) СК ( стволовые клетки ). Потенции генома этих клеток существенно различаются по свойствам и ассортименту воспроизводимых ими специализированных клеток.

Эмбриональные СК ( стволовые клетки ) (ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ )) – возникают на ранних стадиях развития зародыша и представляют собой клетки с тотипотентными или плюрипотентными свойствами. Именно эти клетки являются истинно стволовыми клетками в организме. На 2-4 сутки развития зародыша (стадия морулы) формируются тотипотентные СК ( стволовые клетки ), которые в условиях in situ способны развиваться до стадии взрослого организма (однояйцевые близнецы).

Оплодотворенную яйцеклетку – зиготу – также относят к тотипотентным СК ( стволовые клетки ), поскольку эта клетка воспроизводит все органы эмбриона и необходимые для его развития экстраэмбриональные структуры: хориональную часть плаценты, пуповину и др. Между тем, для биоэтически допустимых экспериментов, а также для получения и сохранения в лабораторных банках тотипотентных ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) используют не зиготы, а клетки-дублеры зиготы. Эти клетки получают лабораторным способом в обход процессов полового оплодотворения и беременности путем переноса ядра из какой-либо аллогенной соматической клетки в зрелую донорскую яйцеклетку, из которой предварительно был удален собственный пронуклеус (получение цитогибридов) [33,47].

Обычно же ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) выделяют из эмбриобласта на 5-7 сутки развития человеческого зародыша (стадия бластоцисты). Эти клетки плюрипотентны и представляют собой группу зародышевых клеток (около 80-100 клеток), являющихся зачатком всех будущих высокоспециализированных клеток. Клетки эмбриобласта способны дифференцироваться во все типы клеток, производные всех трех эмбриональных зародышевых листков, образовывать любые ткани организма, но не цельный организм, поскольку эти клетки не участвуют в образовании экстраэмбриональных структур (плаценты, пуповины и др.)

ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) характеризуются высоким уровнем экспрессии теломеразы [6], а также выработкой специфического транскрипционного фактора Oct-4, который необходим для поддержания фенотипа ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) и играет ведущую роль в детерминировании ранних этапов эмбриогенеза и дифференцировки.

Для ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) человека характерно также наличие на поверхности мембран ранних эмбриональных антигенов – SSEA-3 и SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, которые позволяют идентифицировать репопуляцонную активность этих клеток.

В более позднюю фазу развития эмбриона (на 5 -12 неделе внутриутробного развития) вплоть до рождения из него выделяют более зрелый тип ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ), которые называют СК ( стволовые клетки ) поздних эмбрионов (5-8 недель гестации) или СК ( стволовые клетки ) плодов (при сроках более 8 недель гестации).

Поскольку поздние зародышевые (фетальные) СК ( стволовые клетки ) выделяют на стадии образования зачатков различных органов, то возможности этих клеток к дифференцировке в различные типы специализированных клеток уже ограничены эмбриональным лепестком их происхождения, а также степенью зрелости (дифференцировки). Именно поэтому поздние зародышевые (фетальные) СК ( стволовые клетки ) относят уже не к плюрипотентным, а мульти- и даже унипотентным клеткам, то есть к клеткам, способным создавать при культивировании лишь ограниченное число клеточных фенотипов.

Мульти- или унипотентность СК ( стволовые клетки ) поздних эмбрионов (фетальных клеток), присущие им свойства хоминга и клеточного химеризма (см. ниже), а также отсутствие опасности образования из них эмбриотератом при трансплантации во взрослый организм (в отличие от истинных ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ), полученных на самых ранних сроках гестации) позволяет рассматривать СК ( стволовые клетки ) поздних эмбрионов (плодов) как разновидность региональных СК ( стволовые клетки ) или СК ( стволовые клетки ) взрослых организмов [6].

Региональные или взрослые СК ( стволовые клетки ) – являются наиболее зрелым типом СК ( стволовые клетки ), которые обнаруживаются в виде редких включений во многих тканях и органах сформировавшегося плода и взрослого организма. Происхождение региональных СК ( стволовые клетки ) (РСК), а также свойства этих клеток остаются пока недостаточно исследованными и поэтому представления о них не всегда точны и несколько различаются у разных авторов. Морфологически РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) трудно идентифицировать, однако эти клетки экспрессируют некоторые уникальные маркеры, которые позволяют выявлять их в тканях. Так, антиген CD34 представлен на большинстве гемопоэтических СК ( стволовые клетки ); Stro-1, CD117, CD133 – на мезенхимальных (стромальных) СК ( стволовые клетки ); белок промежуточных филаментов нестин – в цитоплазме нейральных СК ( стволовые клетки ) и т.д.

Как и ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ), РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) относят к числу недифференцированных клеток, которые однако репопулируют циклично в течение длительного периода времени, продолжительность которого определяется сроками сохранности процессов самообновления клеток в органах и тканях.

Принято считать, что при дифференцировке in vivo РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) проявляют лишь унипотентные свойства, за счет которых восполняется пул специализированных клеток и поддерживается стабильность процесса самообновления ткани (физиологическая регенерация). В то же время некоторые авторы [72] полагают, что при повреждении ткани РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) могут приобретать свойства мультипотентных СК ( стволовые клетки ) и дифференцироваться в другие типы клеток, имеющие общность эмбрионального лепестка происхождения. Между тем, отчетливо мультипотентные свойства РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) в настоящее время показаны лишь при культивировании в условиях in vitro и не для всех типов РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ).

По мере старения организма количество РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) в органах прогрессивно уменьшается. Так, если в зародыше млекопитающих на стадии органогенеза половина всех клеток приходится на провизорные некоммитированные клоны СК ( стволовые клетки ), то уже в фетальной печени 1 стволовая гемопоэтическая клетка приходится на 100 000 гематогенных клеток. В кроветворной ткани взрослого человека 1 стволовая клетка приходится на 2-10 млн. коммитированных гемопоэтических клеток (т.е. клеток разной степени дифференцировки) [13].

С возрастом в костном мозге уменьшается не только общее количество гемопоэтических СК ( стволовые клетки ), но особенно количество мезенхимальных (стромальных) СК ( стволовые клетки ).

Так, если сразу после рождения в костном мозге на 10 000 гемопоэтических СК ( стволовые клетки ) приходится 1 стромальная СК ( стволовые клетки ), то у подростков этих клеток уже в 10 раз меньше; к 50-ти годам на 500 000 кроветворных  СК ( стволовые клетки ) – приходится 1 стромальная СК ( стволовые клетки ), а в 70 лет 1 стромальная СК ( стволовые клетки ) приходится на1 млн. гемопоэтических СК ( стволовые клетки ).

Возрастное снижение пула СК ( стволовые клетки ) в органах может быть обусловлено тем, что более продвинутые в дифференцировке клетки не только конкурируют со стволовыми/прогениторными клетками за лимитирующие факторы питания, но секретируют также в среду факторы, блокирующие мультипотентность генома незрелых клеток [13].

Возрастное снижение пула РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) в органах, их сниженная теломеразная активность, унипотентность и проявление мультипотентных свойств лишь в специально созданных условиях микроокружения, а также трудности выявления четких различий между РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) и клетками-предшественниками, которые, как известно,  являются частично дифференцированными клетками, заставляет предполагать, что РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки ) в органах не являются истинными СК ( стволовые клетки ), а являются коммитированными клетками-предшественниками.

2.2. Получение и свойства стволовых клеток

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ )).

ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) официально пока не используются в клинической медицине из-за морально-этических и правовых проблем, связанных с прекращением развития человеческих зародышей, а также опасности перерождения отдельных популяций этих клеток в злокачественные тератокарциномные опухоли после трансплантации во взрослый организм (25-30% наблюдений по Odorico et al. [64]). Однако, несмотря на это, в ведущих медицинских центрах мира уже более 5 лет не прекращаются интенсивные научные исследования условий выращивания бессмертных линий ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) и их направленной дифференцировки в различные типы соматических клеток, так как технологическая возможность осуществления ген-индуцированной селекции этих клеток делает ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) уникальным потенциальным источником сырья для получения промышленных объемов высокоэффективных очищенных стандартизированных клеточных препаратов. Другими словами, ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) представляют собой новый мощный биоресурс медицины.

Для получения лабораторных линий дифференцированных соматических клеток обычно используют 3 природных источника ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ): бластоцисты человека (4-6 дней гестации), половой зачаток фетусов 4-5- недель развития, а также клетки зародыша на стадии гаструляции (8-12 дней гестации), которые еще поддаются репрограммированию в линии ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ).

Однако основным источником сырья для получения клонов ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) остаются бластоцисты человека после искусственного оплодотворения яйцеклетки в условиях in vitro. Принято считать, что зародыш на стадии бластоцисты представляет собой "стволовую нишу", в которой четко разделены эмбриобласт и поддерживающие его клетки трофобласта, выполняющие роль своеобразного фидера. Клетки трофобласта вырабатывают кофакторы выживания и защиты, которые необходимы для сохранения и пролиферации плюрипотентных клеток внутреннего зародышевого слоя. Одновременно эти клетки блокируют неконтролируемую пролиферацию эмбриобласта (позже эпибласта) in situ. Только малая доля клеток эмбриобласта на этапе бластоцисты сохраняет тотипотентность, так как только 1-2% клеток удается переводить в бессмертную самопроизводящуюся линию ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) [13].

Репрограммирование эмбриобласта в линию ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) начинают с механического отделения эмбриобласта от трофобласта. Затем фрагменты эмбриобласта помещают на "фидер" из фетальных фибробластов без факторов, ограничивающих пролиферацию тотипотентных клеток.

Thomson et al. [77] предложили для выращивания ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) использовать среду Дульбекко над облученным фидером (ингибирована пролиферация фетальных фибробластов) с одновременным добавлением в среду культивирования 3-х ростовых цитокинов – LIF (leukemia inhibitory factor), IL-6, SCF (stem cell factor). Для более активной пролиферации ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) рекомендуется дополнительно использовать FGF-base, EGF, TGF-?.

В последние годы были разработаны методы длительного пассирования ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) в течение 1- 2-х и более лет без изменения их гено/фенотипа, причем культуры ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) могли пройти за этот срок более 450 циклов самоудвоения без анеуплоидии и малигнизации. Необходимо подчеркнуть, что рост ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) в культуре идет клонами с образованием клеточных агрегатов (эмбриоидные тельца).

Образование эмбриоидных телец начинается с агрегации однородных СК ( стволовые клетки ), которые пролиферируют и по мере нарастания клеточной массы (клеточности) изменяют состав внутренней локальной микросреды с формированием концентрационных градиентов веществ, которые приводят к изменению экспрессии генов и развитию процессов дифференцировки клеток внутри эмбриоидного тельца. Процесс формирования градиента концентраций веществ протекает динамично по мере нарастания клеток и касается в первую очередь изменений концентраций СО2, NO, O2, глюкозы, а затем состава пептидов и факторов роста. Это в свою очередь меняет характера межклеточных «cell-cell» взаимодействий и ведет к формированию клеток различных по направлению дифференцировки. Когда клеточные агрегаты достигают размеров 50-80 клеток, наступает равновесие между пролиферацией и апоптозом. Спонтанную дифференцировку и гибель клеток обычно предотвращают повторным диспергированием агрегатов.

Дифференцировка ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) наступает после смены среды, удаления фидера и LIF, а также добавления сыворотки, что ведет к прикреплению клеток к подложке, образованию монослоя и формированию их цитоскелета.

Для прикрепления клеток к подложке добавляют не только сыворотку, но и индукторы цитодифференцировки в строго определенных концентрациях, преимущественно белки, которые участвуют в ранних стадиях формирования различных клеточных типов. Для этих целей используют активин А, который индуцирует преимущественно мезодермальную дифференцировку и главным образом образование мышечных клеток (скелетных, кардиомиоцитов); эпидермальный фактор роста, который индуцирует образование мезодермальных и эктодермальных клонов (специфичен для образования клеток кожи); нейрогенный фактор роста, который способствует образованию клонов клеток мезодермы, эктодермы и эндодермы (специфичен для образования клеток печени и эндокринной части поджелудочной железы). При обработке ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) нейрогенным фактором роста и ретиноевой кислотой формируется клеточная популяция, содержащая около 50% клеток, несущих маркеры нервных клеток (окраска антителами к нестину, виментину, polysyalated – NCAM, MAP-2, NeuN, betaIII-tubulin) [13].

Предполагают, что ретиноевая кислота может также выступать в роли индуктора образования мультипотентных мезенхимальных клонов в культуре, которые далее в зависимости от используемых доз и дополнительного набора сигнальных молекул и генов "второго эшелона", определяющих направление цитодифференцировки, воспроизводят адипогенез, миогенез, кардиогенез и т.д.

Экспрессии генов созревания кардиомиоцитов способствует также добавление в среду культивирования ДМСО, который выполняет роль вектора для доставки гидрофобных сигналов (ретиноевая кислота, цитокины с гидрофобными доменами) в ядро ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ). Накопление кислородных радикалов и электрическая стимуляция ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) в культуре также ускоряют образование зрелых спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов [48]. Показано [51], что в эмбриональных агрегатах ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) можно добиться также дифференцировки клеток в хондроциты, причем в роли главных сигналов хондрогенеза выступают подобранные концентрации белков BMP-2, BMP-4 и TGF-?, вырабатываемых, как известно, клетками мезенхимы. Фидер OP9 из стромальных клеток, а также VEGF, FGF-? и HGF поддерживают рост эндотелиальных клонов мезодермы.

Показано, что дифференцировка ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) в нейроны, кардиомиоциты и клетки других фенотипов (хондроцитов) идет in vitro в среднем 10-15 дней, тогда как аналогичный процесс в зародыше занимает 5-7 дней. Очевидно, это связано с тем, что наработка соматических клеток из ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) идет в обход эмбриогенеза, когда отсутствуют условия для организованного взаимодействия мезенхимы и провизорных клонов клеток всех трех зародышевых листков. В результате только часть событий клеточного и органного морфогенеза хаотически воспроизводится в культуре эмбриоидных агрегатов.

Важно отметить также, что при создании условий дифференцировки клеток в определенном направлении только незначительная часть клеток начинает проявлять свойства заданного фенотипа (не более 1/3). Именно поэтому получение клеток определенного фенотипа пока представляет собой непростую задачу, решение которой  осуществляется путем этапных воздействий определенными химическими сигналами на спонтанно формирующиеся эмбриоидные агрегаты ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) (обычно мыши и/или человека) с расшифровкой экспрессирующихся при этом генов, а также путем ген-индуцированной стимуляции дифференцировки в предварительно трансфецированных ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) [13]. Так, стимуляции кардиогенеза в ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) достигают избыточной дозой введенного в клетки гена Nкх-5-2, эритропоэза – избыточной дозой Hох-B4, нейрогенеза - избыточной дозой Neuro-D, миогенеза – MyoD гена. Дифференцировка эмбриоидных агрегатов ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) в гепатоциты достигалась введением в клетки гена резистентности к бластоцидину S (антибиотик) под промотор маркерного гена Oct4, а также использованием селективного красителя индоцианина зеленого для отбора колоний появляющихся гепатобластов, которые далее в культуре дифференцируются до кластеров распластанных гепатоцитов. Получениию инсулин- и глюкагон-секретирующих клеток сопутствует осуществление направленной дифференцировки эмбриоидных агрегатов ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ) в клоны нейральных стволовых клеток, обогащенных нестин+.-клетками, т.к. образование гормон-продуцирующих клеток всегда происходило среди колоний нейросфер и параллельно дифференцировке нейральных стволовых клеток. В результате культивирования в таких условиях 18% нейросфер дифференцировались в инсулин- и глюкагон-секретирующие клетки, а 20% нейросфер – дифференцировалось в клетки с нейрональными и гормон-продуцирующими свойствами одновременно [13].

Так как клетки, образующиеся в процессе дифференцировки ЭСК ( ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ), приобретают способность стабильно и длительно сохранять свой фенотип в лабораторных условиях (в отличие от РСК ( региональные или взрослые стволовые клетки )), то это свойство искусственно полученных соматических клеток открывает перспективу наработки и хранения терапевтически эффективных доз дифференцированных клеток, а также применения их с лечебными целями.

Продолжение