Использование высоких клеточных технологий в лечении
болезней и травм нервной системы
Еще относительно недавно считалось, что
нервная ткань взрослых млекопитающих не способна
восстанавливаться после повреждений, а частичное
восстановление функций, например, после инсульта, происходит
за счет того, что функции поврежденных участков берут на
себя другие части мозга.
Но в последние годы было
обнаружено, что в нервной ткани все же идут процессы
репарации, главным образом за счет нервных стволовых клеток
(НСК), которые могут мигрировать к месту повреждения из
определенных отделов мозга (субвентрикулярной зоны боковых
желудочков и субгранулярного слоя зубчатой извилины
гиппокампа). Нейральные стволовые клетки (НСК) обладают
способностью к неограниченному росту
и дифференцировке в три основных типа клеток ЦНС - нейроны,
астроциты и олигодендроциты. НСК могут быть получены in
vitro из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), а также из
мезенхимальных стволовых клеток (МСК).
Имеется много работ (многие из
которых - опыты на животных, в дальнейшем перешедших в
клинику), демонстрирующих способность МСК костного мозга при
химической индукции меркаптоэтанолом (BME), BHA (butylated
hydroxyanisole) и ДМСО (DMSO) дифференцироваться во все
нервные клетки как in vitro, так и in vivo (Mezey et al.
2000, Woodbury et al. 2000). Есть и другие возможности
получения НСК: терапевтическое клонирование,
трансдифференцировка в нейрональные стволовых клеток печени,
гемопоэтичеких (Eglitis, Mezey 1997), жировых. Кроме того,
многими исследователями были получены различные клетки
нервной ткани из стволовых клеток - как из эмбриональных,
так и из взрослых мезенхимальных. Нейрональные клетки можно
получить из стволовых клеток скелетных мышц (Young et al.
2001, Romero-Ramos et al. 2002, Vourc'h et al. 2004). Уже
более 20 лет предпринимаются попытки использовать для
лечения некоторых заболеваний фетальную нервную ткань
(фетальные НСК). Стабильные клональные иммортализированные
линии человеческих НСК были получены из фетального
теленцефалона. Клетки этих линий могут быть использованы для
трансплантации, они активно мигрируют к месту повреждения и
встраиваются в поврежденный мозг в опытах на животных
моделях болезней Паркинсона, инсульта, хореи Гентингтона,
мукополисахаридоза (Ishibashi et al. 2004, Kim SU 2004,
Kelly et al. 2004). Доказана возможность дифференцировки и
стимуляции нейрогенеза клетками костного мозга (как
гемопоэтического так и стромального ряда) во взрослом
организме; имеется ряд исследований, указывающих, что клетки
костного мозга способны сливаться с нейронами Пуркинье
(Alvarez-Dolado et al. 2003, Weimann et al. 2003). После
трансплантации костного мозга часть клеток проникает через
гемоэнцефалический барьер и превращается в нейроны.
Исследовали головной мозг 4
женщин-реципиентов мужского костного мозга, умерших в
течение 1-9 месяцев после трансплантации. Основные показания
к трансплантации костного мозга - различные формы лейкозов.
У всех умерших находили донорские клетки с У-хромосомой в
различных областях мозга. Большинство из них экспрессировали
не нейрональные маркёры (эндотелиоциты и пр.), однако часть
клеток гиппокампа и коры имели маркёры нейронов. Наибольшие
число нейронов - 7 из 10 000 донорских клеток было
обнаружено у самой молодой реципиентки, прожившей дольше
остальных после трансплантации. (Mezey et al. 2003). Спустя
4-6 лет после трансплантации были исследованы постмортальные
срезы головного мозга 3-х женщин, получивших трансплантацию
костного мозга по поводу лейкемии от мужчин-доноров.
Нейроны, содержащие Y-хромосому, были обнаружены во всех
трёх случаях в гиппокампе. Их общее количество составило 1%
от всех остальных. Трансгендерные астроциты и микроглия
обнаруживались с частотой 1-2%. Признаков слияния клеток
исследователи не обнаружили, поскольку во всех
трансгендерных клетках присутствовала только 1 X-хромосома.
Таким образом, это исследование показывает, что
гемопоэтические стволовые клетки костного мозга способны к
прямой трансдифференцировке в нейроны, астроциты и
микроглию, без признаков слияния. (Cogle et al. 2004).
Для лечения нейродегенеративных
заболеваний, таких, как болезнь Паркинсона и болезнь
Альцгеймера, наиболее многообещающими считаются два
направления, в которых в последние годы ведутся интенсивные
исследования: трансплантация экзогенных
нервных клеток, которые заменят утраченные, и стимуляция
пролиферации эндогенных нервных стволовых клеток. (Limke,
Rao 2003).
Болезнь Паркинсона (БП)
- прогрессирующее
нейродегенеративное заболевание, в основе которого лежит
гибель дофаминэргических нейронов головного мозга,
приводящая сначала к тремору и мышечной ригидности, а затем
к нарушению постуральных рефлексов и движений во всем теле.
Для лечения используется
заместительная терапия дофамином (леводопа) - пациенты
вынуждены принимать его длительное время. Поскольку
количество погибших дофаминэргических нейронов восполнить
невозможно, то болезнь прогрессирует и на сегодняшний день
не существует возможности воздействовать на этот процесс.
Было проведено множество
исследований на животных моделях БП, показавших
эффективность замещающей терапии фетальными нервными
клетками и тканями (Perlow 1987, Sladek, Gash 1988,
Lindvall, Bjorklund 1989, Dunnett 1991). Клеточная терапия
БП в клинике разрабатывается уже более 15 лет (Lindvall et
al. 1989) и направлена на замещение дефектных нейронов
чёрной субстанции (ЧС) новыми - дофамин-продуцирующими. В
качестве клеточно-тканевого трансплантата в клинике
используется зачаток черной субстанции или мезенцефалона
человеческих эмбрионов 7-10 недель гестации. Более 10 лет
назад была запущена международная программа по
нейротрансплантации для лечения нейродегенеративных
заболеваний (в том числе и БП) - NECTAR. Результаты
противоречивы - в одних исследованиях есть явные улучшения
(см. ниже), в других - нет достоверных отличий от плацебо
(Olanow et al. 2003). Примеры обнадеживающих результатов:
Трансплантация фетальной ткани улучшила моторику и уменьшила
дискинезию. Исследование мозга после смерти пациента
показало, что трансплантированные нейроны прижились и
обеспечили реиннервацию стриатума - за счет донорских клеток
было образовано 78% нервных связей (в postcommissural
putamen)(Kordower et al. 1998).
В другой работе у всех пациентов
было показано хорошее приживление трансплантата фетальных
дофаминэргических нейронов и значительное увеличение
продукции дофамина; в группе пациентов моложе 60 лет
наблюдалось некоторое клиническое улучшение (моторики)
(Freed et al. 2001, Nakamura et al. 2001). В другом
исследовании на 40 добровольцах с БП пациенты были разделены
на две группы с одинаковой изначальной степенью поражения
клеток мозга в возрастной категории порядка 60 лет. Пациенты
не принимали специфического лечения (леводопа). Первой
группе пациентов производилась интрацеребральная имплантация
культуры фетальных клеток черной субстанции, а контрольной -
плацебо-операция. Эффективность лечения определялась
временем реакции и скоростью движения верхних и нижних
конечностей спустя 4 и 12 мес. после имплантации.
В результате в контрольной группе
(плацебо) у пациентов старше 60 лет отмечалось значительное
прогрессирование заболевания, а у больных младше 60 лет
отмечалось плато стабилизации в течение 4 мес. с последующим
прогрессированием болезни. В экспериментальной группе в
обеих возрастных категориях (<60 и >60 лет) отмечалось
улучшение состояния без дополнительного применения
специфической терапии леводопой.
Скорость реакции и движения
улучшились и сохранялись на достаточно высоком уровне, по
крайней мере, в течение 12 мес. (Gordon et al. 2004). При
трансплантации ткани фетального мезенцефалона происходит
приживление дофаминэргических нейронов и реиннервация
стриатума, восстановление синтеза дофамина и уменьшение
симптомов болезни. Но есть несколько проблем, связанных с
использованием фетальной нервной ткани: ограниченность
ресурса и невозможность обеспечить всех пациентов;
вариабельность результатов трансплантации - у некоторых
пациентов наблюдается значительное улучшение, у других -
слабое, у третьих - никакого; у значительной части пациентов
после трансплантации возможны осложнения - например,
развивается дискинезия (Lindvall 2003). Для улучшения
результатов клеточной терапии БП предлагается использование
дофамин-продуцирующих нейронов, полученных из эмбриональных
и мезенхимальных стволовых клеток (Lindvall 2003, Sayles et
al. 2004, Levy et al. 2004) и поиск радикально новых
подходов: например, применение ген-модифицированных клеток,
продуцирующих дофамин (Kim SU. 2004, Kim DW. 2004). Было
выполнено несколько работ по получению продуцирующих дофамин
нейронов и других нервных клеток из человеческих ЭСК. В
частности, это было сделано в бессывороточной среде;
трансплантированные крысам с моделью БП, эти клетки давали
значительное улучшение их состояния и обнаруживались в мозге
по меньшей мере через 8 недель после трансплантации (Schulz
et al. 2004).
Исследования
В настоящее время возможности
клеточной терапии с использованием различных видов стволовых
клеток продолжают отрабатываться на животных. Крысам с
моделью БП трансплантировали нервные клетки,
дифференцированные из мышиных ЭСК, меченых геном зеленого
флуоресцентного белка. Через три недели симптомы болезни у
крыс в значительной мере уменьшались и этот эффект
сохранялся по меньшей мере 6 месяцев. В мозге крыс
обнаруживались тирозингидроксилаза-положительные нейроны,
дифференцировавшиеся из донорских клеток, которые и
обеспечивали терапевтический эффект (Xu et al. 2004).
В другом исследовании сравнивали
эффективность аллотрансплантации фетальной ткани
вентрального мезенцефалона и ксенотрансплантации
дофаминэргических нейронов, полученных из ЭСК. Хотя оба типа
трансплантатов приживались примерно одинаково и давали
примерно равное количество и одинаковую локализацию
тирозингидроксилаза-позитивных клеток, влияние их на
поведение крыс с моделью БП было различным: значительное
улучшение после трансплантации фетальной ткани и слабое -
после трансплантации нейронов. Это показывает различия во
взаимодействиях между нейронами реципиента и двумя видами
трансплантатов (Yurek, Fletcher-Turner 2004). Показана
терапевтическая эффективность клеток, полученных методом
терапевтического клонирования. Был применен метод
терапевтического клонирования для получения НК с последующей
их трансплантацией мышам с моделью паркинсонизма. Получали
различные типы НК - нейроны (допапин-, серотонинэргические,
мотонейроны), астроциты, олигодендроциты. Допаминергические
нейроны, полученные из ЭСК разными методами, сравнивали in
vitro и in vivo. Было показано, что при использовании одного
протокола выделения НК при разных методах получения ЭСК
(бластоцист) между ними нет различий ни по метаболизму, ни
по терапевтическим возможностям. Введённые НК эффективно
нормализовали клинические проявления паркинсонизма у мышей
(Barberi et al. 2003). Одна из линий человеческих НСК,
полученных из фетального теленцефалона, была генетически
модифицирована, так что клетки синтезировали
L-дигидроксифенилаланин (L-DOPA). Трансплантированные в мозг
крыс с БП, эти клетки восстанавливали нарушенные функции.
Кроме того, они увеличивали выживаемость нейронов реципиента
при повреждающем воздействии тринитропропионовой кислоты у
крыс с моделью хореи Гентингтона. При внутривенном введении
крысам с моделью инсульта НСК мигрировали в область ишемии и
дифференцировались в нейроны и клетки глии, улучшая
функциональное состояние мозга (Kim SU 2004). Полученные из
ЭСК приматов дофаминэргические нейроны трансплантировали
приматам с моделью БП и получили значительное улучшение
функций и уменьшение симптомов (Takagi et al. 2005). Из
человеческих ЭСК была получена культура нейральных
прогениторов, и эти клетки трансплантировали крысам с
моделью БП. Было показано, что трансплантат выживает по
меньшей мере в течение 12 недель, донорские клетки
дифференцируются в дофамин-продуцирующие нейроны и
значительно улучшают состояние крыс. Образования тератом не
наблюдалось (Ben-Hur et al. 2004).
Болезнь Альцгеймера (БА)
- первичное дегенеративное
заболевание головного мозга, возникающее обычно после 50 лет
и характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта,
нарушением памяти и изменением личности.
Количество больных во всем мире
составляет почти сорок миллионов человек. Накопление
сенильных бляшек и дегенерация нейронов приводят к
нарушениям синаптической передачи, в особенности
холинергической. В терапии БА применяются холиномиметические
средства, многие из которых токсичны и малоэффективны. В
последнее время разрабатываются методы генотерапии
различными нейротрофическими факторами. Например,
проводились опыты на стареющих обезьянах - было показано,
что трансплантация ген-модифицированных клеток в головной
мозг и продукция ими NGF существенно увеличивает
холинергическую иннервацию коры, стремительно снижающуюся с
возрастом, и предотвращает гибель нейронов (Conner et al
2001). В клиническом исследовании приняли участие 8 человек
с подтверждённым диагнозом болезни Альцгеймера на разных
стадиях. Аутологичные фибробласты кожи трансфецировали геном
NGF, и вводили эти клетки в область базальных ядер головного
мозга. Один пациент умер через 5 недель после трансплантации
от инфаркта миокарда. Морфологическое исследование его мозга
показало, что введённые клетки прижились и продуцировали
NGF. У остальных пациентов отмечалось 50%-е снижение
ежегодного нарастания степени когнитивных расстройств. Такая
динамика сохранялась в течение двух лет. Данные томографии
указывали на увеличение степени метаболической активности
тех областей мозга, которые деградируют в первую очередь при
развитии болезни. Таким образом, клинический эксперимент
подтвердил безопасность и перспективность метода (Tuszynski
et al. 2005).
Проводились ограниченные
клинические испытания по лечению хореи Гентингтона
трансплантацией фетальных нервных клеток. Исследование после
смерти одного из пациентов показало, что донорские клетки
выжили, не были затронуты нейродегенеративными процессами и
частично заменили утраченные нейроны (Freeman et al. 2000).
Инсульты
При инсульте
поражаются разные области мозга и различные популяции
нейронов, а также клеток глии и эндотелия. Чтобы
восстановить все эти утраченные клетки и взаимодействия
между ними, материал для трансплантации должен быть
представлен незрелыми клетками с возможностями
дифференцировки по нескольким путям.
Считается, что трансплантация
клеток может усилить воспалительные процессы в остром
периоде, в это время также будет затруднено приживление
донорского материала. С другой стороны, на животных моделях
ранняя трансплантация дает значительный положительный эффект
- донорские клетки ускоряют нейрогенез, уменьшают апоптоз и
положительно влияют на процессы формирования рубца в месте
повреждения. Остается открытым и вопрос о месте
трансплантации - видимо, клетки действительно плохо выживают
в зоне повреждения, но могут быть введены в область пенумбры
или даже в противоположное полушарие; для некоторых типов
клеток описан хороший эффект при внутривенном введении (Li
et al. 2001, Savitz et al. 2004).
Проводились преклинические и 1-2
фаза клинических испытаний с нейронами, полученными из
иммортализированной клеточной линии NT2N (производства
Layton Bioscience, Inc. - "LBS neurons for human
use")(Borlongan et al. 1998, Bani-Yaghoub et al. 1999).
Клетки трансплантировались в стриатум пациентам с инфарктами
давностью от 6 месяцев до 6 лет в дозе 2 или 6 млн;
применялась иммуносупрессия.
За 4 года после этого не
наблюдалось никаких осложнений, связанных с
трансплантированными клетками; было показано улучшение
моторных функций, но отличия от контрольной группы были
недостоверными; у нескольких пациентов отмечались улучшения
запоминания (Nelson et al. 2002). 1 фаза клинических
испытаний трансплантации в послеинфаркный стриатум фетальных
клеток из примордиального стриатума свиней (LGE) была начата
в 1998 году. Ранее на животных было показано, что эти клетки
дифференцируются в нейроны стриатума и образуют связи с
нервными клетками хозяина (Isacson et al. 1995, Deacon et
al. 1994, Jacoby et al. 1999). Однако достоверных
долговременных улучшений состояний пациентов доказано не
было. (Dinsmore et al. 2002).
Проводились ограниченные
клинические испытания использования для лечения инсульта
эндолюмбальной трансплантации нейральных стволовых клеток,
полученных при культивировании клеток фетальной нервной
ткани. В последующие 3-6 месяцев отмечался более быстрый
регресс симптоматики по сравнению с контролем; инвалидизация
по шкале Barthel составляла минимальное значение (Миронов и
др. 2003).
Исследования
Было проведено множество опытов на
животных с моделью инсульта, в которых вводились
мезенхимальные стволовые клетки костного мозга. Было
показано, что они мигрируют к месту повреждения,
дифференцируются в клетки различных типов, в том числе в
нейроны, астроциты и эндотелиоциты, выделяют различные
трофические и ростовые факторы и дают значительное
восстановление поврежденных функций. Число клеток донорского
происхождения с маркерами нервной ткани, впрочем, очень
мало, и положительный эффект достигается главным образом за
счет стимуляции процессов нейрогенеза и ангиогенеза хозяина
и уменьшения апоптоза нервных клеток.
Например, человеческие МСК КМ
вводили крысам внутривенно через сутки после окклюзии
средней мозговой артерии. Морфологически было показано
увеличение числа сосудов и новообразование капилляров на
границе ишемического очага. У крыс наблюдалось повышение
уровня эндогенного фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF)
в 0.7 раз. На культуре клеток сосудистого эндотелия
головного мозга мыши было показано, что при добавлении
супернатанта среды, кондиционированной СК КМ, происходит
значительная стимуляция образования капилляров. Этот эффект
блокировался при добавлении в культуру нейтрализующих
антител к VEGFR2. Таким образом, ангиогенез-стимулирующий
эффект СК КМ при ишемическом инсульте опосредован повышением
концентрации VEGF и его рецептора (Chen et al. 2003).
Доказано, что выделяющиеся при
инсульте вещества дают повышение синтеза нейротрофических и
ангиогенных факторов трансплантированными СК КМ. Если в
культуру СК КМ добавляли экстракты из головного мозга крыс с
инсультом, наблюдалось значительное повышение синтеза
нейротрофических (brain-derived neurotrophic factor (BDNF) и
nerve growth factor (NGF)) и ангиогенных (vascular
endothelial growth factor (VEGF) и hepatocyte growth factor
(HGF)) ростовых факторов (Chen et al. 2002). Обнаружены
вещества, обеспечивающие хемотаксис введенных МСК к области
повреждения (Hill et al. 2004). В отношении МСК остаются
невыясненными еще много вопросов: какова их конечная судьба
в тканях мозга - дифференцируются ли они в зрелые клетки и в
какие именно? Остаются ли они в месте повреждения и долго ли
выживают там? Как при внутривенном введении избежать
рассеивания большей части донорских клеток по другим
органам?
Ведутся исследования и других
возможных источников клеток для лечения инсульта.
Внутривенное введение крысам через сутки после инсульта
человеческих клеток пуповинной крови
через 14 дней дало значительное улучшение нарушенных
поведенческих функций по сравнению с контролем (Chen et al.
2001). Было показано, что степень улучшения практически не
различается при внутривенном введении и введении в стриатум,
а долговременный эффект лучше при внутривенном введении (Willing
et al. 2003). Механизм действия, видимо, такой же, как у МСК
КМ и главным образом определяется выделением трофических
факторов и стимуляцией ангиогенеза (Taguchi et al. 2004,
Peterson 2004). Введение МСК, полученных из человеческой
жировой ткани, в боковой желудочек мозга крыс через
сутки после инсульта через 7 дней давало значительное
улучшение поведенческих функций; было показано, что
донорские клетки мигрируют в различные области мозга и
выживают не менее 30 дней (Kang et al. 2003). Показано, что
увеличение числа гемопоэтических СК - как в
результате стимуляции размножения эндогенного пула, так и в
результате трансплантации - дает значительное улучшение
функций мозга после ишемических повреждений (Haas et al.
2005). Человеческие НСК, полученные из эмбриональных
стволовых клеток и меченые Lac-Z, внутривенно вводили
крысам на второй день после инсульта. Группе контроля
вводили физиологический раствор. Клетки мигрировали в зону,
граничащую с гематомой, и дифференцировались в нейроны (10%
клеток) и астроциты (75%); в опытной группе было
зафиксировано более быстрое функциональное восстановление по
сравнению с контролем.
Таким образом, показано, что
стволовые клетки способны к миграции и обладают тропностью к
очагу поражения; доказан положительный эффект применения НСК
при кровоизлиянии в мозг (Jeong et al. 2003). В другом
исследовании для лечения смоделированного на крысах инсульта
использовали недифференцированные крысиные ЭСК, которые
трансплантировали в контрлатеральное полушарие головного
мозга. ЭСК мигрировали в зону инсульта через мозолистое тело
и дифференцировались в нейроны и глию. При трансплантации
крысиных ЭСК в мозг мыши клетки не мигрировали, а давали
злостный рост терaтокарцином (Erdo et al. 2003). В опытах на
крысах показано, что ишемическое повреждение мозга
стимулирует нейрогенез в субвентрикулярной зоне и миграцию
новых нейронов к области пенумбры, где они участвуют в
восстановлении утраченных функций (Jin et al. 2003).
Возможно улучшение результатов
клеточной терапии при использовании ген-модифицированных
стволовых клеток, введения во время трансплантации
стимулирующих нейрогенез и ингибирующих апоптоз веществ и
других современных методов (показано при лечении инсульта на
крысах)(Kurozumi et al. 2005, Szentirmai, Carter 2004,
Hanabusa et al. 2005, Komitova et al. 2005).
Готовятся клинические испытания по
применению в терапии инсультов вышеописанных типов клеток,
давших хорошие результаты в опытах на животных. Но следует
иметь в виду, что животные модели не вполне адекватны для
изучения клеточной терапии хронической фазы инсультов,
особенно это касается долговременных последствий процедуры (Savitz
et al. 2004).