СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

 В клинике лечебной косметологии «Версаль» (г. Екатеринбург) проведено исследование эффективности препарата фетальных легочных фибробластов, выпускаемого Екатеринбургским НИИ вирусных инфекций под названием «Культура диплоидных клеток человека для заместительной терапии». Количество пролеченных пациентов составило   61 человек, в т.ч. 43 женщины и 16 мужчин. Возраст пациентов - от 21 до 62 лет. Использованы следующие способы введения препарата:

-Аппликация на кожу чистого препарата;

-Аппликация на рану чистого препарата под повязку;

-Аппликация препарата на кожу под маски и кремы;

-Нанесение препарата, предварительного смешанного с масками и кремами;

-Введение препарата в кожу при помощи ультразвука, ионофореза, электрофореза;

-Внутритканевые инъекции препарата (внутрикожные, подкожные, в ткань рубца).

Препарат клеток использовался для лечения угревой болезни, возрастных изменений кожи, включая морщины кожи лица, рубцовых изменений кожи, а также алопеции и гнездовой плешивости. Проведенные исследования препарата подтвердили высокую эффективность его применения  в косметологии при лечении широкого спектра  заболеваний. Не было выявлено ни одного случая осложнений, связанного с использованием культуры фибробластов. По результатам исследования препарат рекомендуется для широкого применения в косметологической практике.

Приведенные данные свидетельствуют о больших возможностях восстановительной терапии с помощью фетальных фибробластов. По нашему мнению, необходимо расширять спектр препаратов на основе фетальных фибробластов. Клеточная терапия основывается на принципе, что больной или стареющий орган должен лечиться или стимулироваться материалом, полученным из подобного органа.

В зарубежной практике первыми зарегистрированными и разрешенными к клиническому применению коммерческими тканеинженерными продуктами стали конструкции для восстановления кожных дефектов, такие как Dermagraft (Smith & Nephew), TestSkin II (Organogenesis), Apligraf (Organogenesis), AlloDerm (Life-Cell) [10,12,13]. В настоящее время, пересадка этих материалов была произведена уже сотням тысяч пациентов с хроническими язвами и ожогами. Однако, существовало мнение, что культивирование in vitro и фабрикация конструкта может структурно и/или функционально изменить ДНК или вызвать экспрессию, не характерных для исходной клетки генов, например онкогенов. Для оценки генетической безопасности широко используемых биокомпозитных материалов было необходимо провести ряд исследований на предмет изменений происходящих в клетках, нанесённых на конструкции при культивировании in vitro.

Рис. 4 Культивирование фибробластов in vitro

В недавнем номере Тissue Еngineering опубликовано сравнительное исследование генетического материала  тканеинженерного продукта TestSkin II (Organogenesis) и клеток, полученных от доноров и культивированных in vitro по стандартному протоколу. TestSkin II был разработан для тестирования дерматотоксичных субстанций и моделирования искусственного дермогенеза in vitro и, получается, по схожей с Apligraf технологии.

Биоптаты кожи были получены от добровольцев мужского пола - новорожденного ребёнка и взрослых (55 и 96 лет). Эпидермальные кератиноциты и фибробласты были выделены и культивированы по стандартному протоколу производства TestSkin II. Затем была выделена их ДНК. Исследование ДНК проводилось с помощью нескольких спектрометрических и хроматографических методов. Отдельно анализировали ген TP53 методом капиллярного электрофореза. Ген ТР53 является антионкогеном и его повреждение наблюдается у большинства пациентов с раком кожи. Кроме того, проводили исследования наличия Y хромосомы (методом FISH), которая может быть "потеряна" при длительном пассировании клеток.

В результате, по данным спектрометрических методов, каких либо статистически значимых различий не было выявлено во всех четырех образцах ДНК. Поскольку известно, что 95% всех мутаций в антионкогене ТР53 происходят на уровне с 5 по 9 экзон [11], была проанализирована именно эта область. С вероятностью более 90%, было показано, что повреждения это гена во всех образцах отсутствуют. При анализе Y-хромосомы после культивирования, было выявлено, что у 96 летнего донора произошла её потеря у 8% кожных фибробластов. Это обстоятельство авторы объясняют как результат старения организма. Также, не было обнаружено окислительных повреждений ДНК, как в донорских тканях, так и в тканеинженерной конструкции TestSkin II.

 В настоящее время можно выделить два основных подхода к лечению дефектов кожи  с помощью препаратов, содержащих нативные фибробласты. С одной стороны, широкую известность  получили методики лечения дефектов кожи раневого и ожогового характера с помощью культур аллогенных фетальных фибробластов [1] . Альтернативой этим методикам является возможность использования собственных фибробластов человека для заместительной клеточной терапии кожных покровов [4].

Каждый из вышеуказанных подходов имеет свои достоинства и недостатки. Целью проведенной в "Technology Serves" работы явилась отработка в специализированных клиниках методик коррекции возрастных изменений кожи с помощью собственных фибробластов кожи и жира пациента, культивированных in vitro.

  Методика была апробирована в Великобритании (Лондон) и на Украине (Киев) у 48 пациентов в возрасте 32-65 лет с признаками естественного увядания кожи лица и шеи.

 Разработка данного метода лечения с применением клеточных препаратов включала три этапа. Прежде всего была отработана воспроизводимая методика приготовления безопасного для человека и предположительно эффективной технологии. Эффективность затем проверяли на созданных с использованием животных и клеточных культур моделях кожи. Затем проводили испытания на ограниченном числе больных в клинике. После успешного завершения данного этапа провели широкие испытания в ряде клиник и на значительном количестве пациентов.  

Клеточный материал для получения культуры аутогенных фибробластов брали путем биопсии кожи пациента в области предплечья, а также из жировой ткани из области живота. Параллельно фетальные фибробласты были получены из кожи 8-12-недельных человеческих эмбрионов, как описано в работе [3].

Получение и культивирование фибробластов из биоптата кожи и жира проводили по стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань промывали физ. раствором, содержащим антибиотики, и обрабатывали раствором, содержащем ЭДТА, трипсин и коллагеназу. Затем клетки первичной культуры центрифугировали, отмывали от ферментов, и ресуспендировали в среде культивирования. При культивировании использовалась среда, содержащая 90% DМЕМ + 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

После наработки достаточного количества клеток (5-6 пассажей в культуре) фибробласты тестировались на отсутствие контаминации ВИЧ, гепатитов А, В и С, ЦМВ, микоплазмы,  хламидий и других инфекционных заболеваний. Тестирование проводилось при помощи ПЦР и иммуноферментными методами. Далее монослойные культуры клеток суспендировали в стерильном физрастворе для инъекций. Готовые суспензии сохраняли при +4 С. Препараты клеток использовали в течение 24 ч после получения.

Процедуру введения клеток пациенту проводили однократно методом туннельных инъекций для крупных морщин, или обкалывания мелких морщин, или мезотерапии кожи лица. Количество клеток в препаратах варьировало в зависимости от процедуры, объем введенного препарата составлял в среднем 10 -15 млн. и доходил за 3 процедуры до 30 - 50 млн. клеток фибробластов кожи и 15 – 25 млн. клеток для фибробластов жировой ткани.   

Выращивание фибробластов проводили, как описано в работе   [3]. Трипсинизацию клеток проводили с помощью версена и трипсина при 4С. По 2 мл взвеси клеток высевали на пластиковые чашки Петри (диаметром 40 мм) и инкубировали клетки в условиях насыщающей влажности при 37оС с  3 - 5% СО». Число колоний определяли на 14 - 18-е сутки после посева клеток. Клетки фиксировали 10%-ным раствором формалина и окрашивали 0.1%-ным раствором метиленового синего. Эффективность метода определяли как отношение числа колоний к числу посеянных клеток.  За эффективность прикрепления принимали отношение числа клеток, прикрепившихся через 12 ч после посева, к числу посеянных. В качестве контроля использовали штаммы фибробластов, полученные из кожи эмбрионов 8-12 недель гестации. Всего изучено 8 штаммов фибробластов человека, 5 - полученных из эмбрионов и 3 - из кожи взрослых индивидуумов.

Жизнеспособность клеток в суспензии определяли с помощью высевания суспензионной культуры через различные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток по их способности к образованию колоний.

 Для фетальных штаммов эффективность колонирования, т.е. способность клеток образовывать колонии, состоящие из 16 и более клеток, колебалась от 38 до 82%, для постнатальных штаммов - от 12 до 60%.   

В работу не входил сравнительный анализ полученного эффекта от введения фибробластов кожи и жира. Однако при введении фибробластов, полученных из жира, результаты «омоложения» кожи значительно превосходили.  

Эффект внутрикожных инъекций  фетальных  фибробластов был изучен у 16 мужчин и женщин, которым однократно вводили по 1-1,5 мл клеточной суспензии. Концентрация клеток составляла 0,25, 0,5, 1,0, 3,0 и 5,0 млн. клеток в мл суспензии. Наилучшие результаты получены при введении 3,0 млн. клеток.  Положительные эффекты наблюдались через 2-3 дня после процедуры и были аналогичны результатам введения собственных клеток. Однако было отмечено, что длительность эффекта «омоложения» от аллогенных фибробластов было короче, чем при введении аутофибробластов.  

  Для коррекции возрастных изменений кожных покровов в настоящее время используются самые разнообразные методы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и препараты (токсин ботулизма ("ботекс"), компоненты внеклеточного матрикса и соединительной ткани и т.д.). Применение культур клеток для омоложения кожи в косметологии началось сравнительно недавно, при этом использовались как фетальные аллогенные [1], так и аутогенные фибробласты [4].     При этом не возникает сомнения об эффективности данного применения для клеточной терапии, особенно у взрослых и пожилых людей.

Считается, что наилучшие результаты клеточной терапии получаются при использовании культур фетальных фибробластов, которые имеют больший пролиферативный потенциал по сравнению с культурами от взрослых доноров. Однако применение клеток, полученных из эмбрионов, имеет ряд ограничений, в том числе этического характера. В то же время накапливаются данные, что собственные фибробласты, равно как и стволовые клетки человека, сохраняют свой потенциал при старении, несмотря на уменьшение их числа в стареющем организме.

В работе Келлера с соавт.  [4] пациентам в возрасте 37-61 года вводили аутогенные фибробласты кожи. Значительный и стойкий клинический эффект наблюдался у пациентов  при коррекции носогубных складок, а также у пациентов с рубцами. Полученные нами результаты также показывают, что фетальные и постнатальные фибробласты оказывают аналогичные положительные эффекты при введении пациентам.    

Тесная взаимосвязь между мезенхимальными стволовыми клетками и фибробластами в культуре отмечена еще в работах первооткрывателя стволовых клеток А.Я.Фриденштейна в середине 60-х годов прошлого столетия [7]. В его лаборатории впервые была получена однородная культура плюрипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга, прикрепленных к подложке, которые сохраняли высокий темп размножения в недифференцированном состоянии во многих пассажах.  Работы Фриденштейна показали, что мезенхимальные стволовые клетки после прикрепления при пересеве с малой плотностью формировали клоны фибробластоподобных нефагоцитирующих клеток.

В дальнейшем связь между фибробластами и мезенхимальными стволовыми клетками была подтверждена другими исследователями, однако имелось мнение, что фибробласты при культивировании утрачивают способность к дифференцировке в другие типы клеток.  В исследованиях последних лет [9] показано, что фибробласты потенциально могут приобретать свойства клеток скелетной мускулатуры, при заданной дифференцировке in vitro, если они трансплантируются в регенерирующую скелетную мышцу.

Также показано, что пролиферативный ответ культивируемых фибробластов на стимуляцию цитокинами и синтез коллагена и неколлагеновых белков после стимуляции трансформирующим фактором роста бета не зависели от возраста донора клеток [6].

Cristofalo с соавт. [5] в недавней работе подвел итог своим многолетним исследованиям по взаимосвязи возраста донора и способности его клеток к пролиферации. Авторы определили продолжительность жизни клеток кожи из биопсийного материала 124 клинически здоровых доноров различного возраста и сделали однозначный вывод, что продолжительность жизни фибробластов в культуре не коррелирует с возрастом донора.

Полученные широкие результаты по эффективности выведения фибробластов также свидетельствуют о сохранении высокого пролиферативного потенциала клеток у взрослых людей при сравнении с фетальными фибробластами.

Одно из объяснений этого феномена состоит в том, что при культивировании аутогенных фибробластов in vitro происходит их частичная реактивация или "омоложение", т.е. возврат в состояние, более близкое к мезенхимальным стволовым клеткам. Первичная культура, полученные после трипсинизации биопсийного материала, содержит как "молодые", так и "старые" клетки. Все эти клетки помещаются в среду, содержащую эмбриональную сыворотку, т.е. в условия, в какой-то степени аналогичные существующим в эмбриональном состоянии. При этом происходит стимуляция пролиферации "молодых" клеток, сохранивших высокие способности к росту, и разбавление или вымывание из культуры "старых" клеток, которые потеряли способность к пролиферации. Таким образом, культура как бы "омолаживается". Не исключена возможность и истинной реактивации или омоложения клеток в таких условиях культивирования, как было показано еще Makinodan при пересадках иммунокомпетентных клеток от старых мышей молодым мышам.

При обратной пересадке в кожу пациента такая реактивированная культура клеток, очевидно, будет активно заселять дерму и усиленно синтезировать весь комплекс компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, необходимый для поддержания кожи пациента в оптимальном физиологическом состоянии. Важно отметить еще раз, что это собственные клетки пациента, которые, «взрослея»,    не будут поглощаться макрофагами в отличие от пересаженных аллогенных фетальных  клеток.

Следует отметить, что в работе Келлер положительный эффект наблюдали как минимум в течение 12 мес. после пересадки аутогенных фибробластов. Метод применения фибробластов кожи и жира является более оптимальным, чем инъекции ботулинового токсина ("ботокса"), который при длительном применении может вызывать дегенерацию нервных окончаний и нарушение трофики кожи. Кроме того, этот  метод является более прогрессивным, чем внутрикожные инъекции компонентов внеклеточного матрикса. Такие инъекции оказывают омолаживающий эффект, но этот эффект кратковременный, и инъекции надо повторять. Кроме того, введение избытка компонентов матрикса может оказывать тормозящее влияние на синтез и секрецию этих компонентов клетками кожи и, таким образом, косвенно ускорять старение фибробластов кожи.

В целом, положительный эффект применения препаратов фибробластов у пациентов указывает  на высокий восстановительный потенциал аутологичных фибробластов для коррекции возрастных изменений кожи. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию схемы терапии, установку индивидуальных доз вводимых фибробластов и наблюдение в динамике для установления отдаленных результатов.

Институтом клеточных технологий совместно с НИИ трансплантологии и искусственных органов, при участии Российского Государственного Медицинского Университета в настоящий момент в лабораторных условиях проводятся научные работы по сравнению белковых маркеров, получение протеомных карт фибробластов, взятых от взрослых доноров из области кожи, мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК КМ), мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани (МСК жира) и фетальных  фибробластов кожи.

В свете вышесказанной проблемы особое внимание заслуживает опубликованная в 2001 году работа Zuk и соавт (Zuk et al., 2001), в которой описан метод получения стромальных фибробластоподобных клеток из жировой ткани взрослого человека и показана их способность дифференцироваться в различные специализированные клетки (остеоциты, хондроциты, миоциты и адипоциты). Выявленный новый, практически неограниченный источник (Aust et al., 2004) адипогенных стромальных клеток (АСК) – как правило, это отходы косметологической липосакции – обещает революционные изменения в сфере клеточной терапии. Перспективы применения АСК для лечения и восстановления поврежденных тканей очень заманчивы и близки, но до начала полного использования их потенциала необходимо разрешить некоторые проблемы.    Так в 2002 году методом “редкой посадки” было получено несколько сотен клонов АСК, каждый из которых представлял результат деления одной клетки. Исследование полипотентности клонов показал, что способностью дифференцироваться в трех направлениях (остеогенном,    адипогенном и хондрогенном) обладает только ~1% АСК (Zuk et al., 2002). При этом, как ни странно,  морфология, и профиль CD маркеров  адипогенных полипотентных клеток (АПК) идентичен клеткам не обладающим какой-либо потентностью (Zuk et al., 2002). Каковы основные последствия данного факта? Несомненно, это серьезное препятствие на пути лабораторного и клинического исследования методов клеточной терапии на основе адипогенных СК, т. к. не представляется возможным охарактеризовать клеточный материал, полученный из отходов липосакции, на предмет содержания в нем стволовых клеток. С другой стороны, это проблема выделения АПК из АСК современными методами сепарации клеток основанных на иммуносорбции (применение магнитных бус, аффинных колонок и  цитосортеров), что требуют знания характерных клеточных антигенов - поверхностных белков клетки взаимодействующих с антителами. Таким образом, существующая проблема идентификации и сепарации по сути стволовых АПК от АСК, по сути обыкновенных фибробластов, может быть решена только сравнительным исследованием этих клеток. Известная их морфологическая, антигенная и генетическая (т.к. общий геном) идентичность делает актуальным дифференциальное описание белкового состава этих клеток. При этом  помимо цитоплазматических белков клеток особый интерес представляют мембранные белки, являющиеся потенциальными мишенями для маркеров цитосортировки (например, меченых антител).

Высокоэффективный протеомный анализ, используемый в работе Института Клеточных Технологий, НИИ трансплантологии и искусственных органов, Российским Государственным Медицинским Университетом  являются методам выбора в случае картирования белков таких сложных биологических систем, какими являются клетки. В соответствии с данным проектом предполагается применение двумерного электрофореза для разделения белков с последующей их идентификацией времяпролетной масс-спектрометрией (2D-PAGE + MALDI-TOF MS).  Подобная схема анализа позволяет прокартировать до 2 тысяч белков биологического объекта. Дифференциальный анализ полученных протеомных карт АПК и АСК позволит выявить отличия в составе цитозольных белков связанных с полипотентностью. Подобные данные, несомненно, являются как ценной научной информацией, так и могут в дальнейшем использоваться для сертифицикации клеточного материала для клинических испытаний.

Таким образом, отрабатываются модели и методы получения препаратов фибробластов из кожи и жировой ткани человека, пригодные для применения в косметологии. Во многих работах показывается сохранение высокой способности к пролиферации фибробластов, полученных от взрослых доноров. Проводятся испытания по применению полученных препаратов для коррекции возрастных изменений кожи. Предварительные данные показывают значительный и стойкий положительный результат, указывают на высокую перспективность применения культуры аутогенных фибробластов в терапевтической косметологии.

Применение фибробластов в клинике эстетической медицины возможно по следующим основным направлениям:

Л.Г.Степанова, С.Б.Алексеев, А.А.Згурский, Г.А.Ломанова, Н.В.Шалунова. Получение и характеристика нового штамма диплоидных клеток из фетальной ткани легкого человека. «Цитология», 1986, т. 28, № 12, с.1373-1376.

Терехов С.М. «Цитология», 1981, 23, 6, 717-718.